![Metodyka pobierania prób materiału szkółkarskiego – truskawka [fitoplazmy]](edc_media/Structure/Item-2322/ArticleImage/820x280mCROPcFEFFFE.jpg)
Metodyka pobierania prób materiału szkółkarskiego do testów laboratoryjnych na obecność fito plazm – Truskawka – Fragaria × ananassa Duchesne L.
Fitoplazmy: żółtaczki astra, wybujałości liści truskawki, stolburu, zielenienia płatków truskawki, ‘Candidatus Phytoplasma fragariae’
Termin pobierania prób
Do testów laboratoryjnych na obecność fitoplazmy próby należy pobierać latem i jesienią. prób
Wybór tkanki/części rośliny do testowania prób
Do testów na obecność fitoplazmy zalecane jest wykorzystywanie nerwów w pełni rozwiniętych młodych liści. prób
Sposób pobierania prób prób
Przy pobieraniu próbek należy kierować się następującymi ogólnymi zasadami:
- Jedna próbka powinna pochodzić z jednej rośliny, oznakowanej w sposób umożliwiający indywidualną identyfikację zainfekowanych roślin (w dalszej części omówiono odstępstwa od tej reguły).
- Wskazane jest oznaczenie (zaetykietowanie) roślin, z których pobrano próbki, chyba, że identyfikacja jest możliwa na podstawie istniejącego oznakowania lub szczegółowego planu nasadzenia.
- Próby należy pobierać do trwale oznakowanych foliowych torebek, zabezpieczając przed nadmiarem wilgoci i wysychaniem (groźniejszy jest nadmiar wilgoci niż wysychanie). Torebki mogą być otwarte tylko, jeżeli będą transportowane bezpośrednio do laboratorium w sposób, który uniemożliwi zamieszanie prób. W każdym innym przypadku próby należy zabezpieczyć przez zamknięcie torebek. Na czas zbierania i transportu, próby należy zabezpieczyć przed nadmiernym nagrzewaniem przez zacieniowanie. W przypadku wyższych temperatur (powyżej 25°C) zaleca się umieszczenie prób w tzw. lodówce turystycznej, pojemniku styropianowym albo "torbie na mrożonki" z wkładem chłodzącym. Nie dopuszczać do zamrożenia prób! Po dostarczeniu do laboratorium próby należy umieścić w chłodzie (+4ºC do +10ºC). Próbki mogą być przechowywane w lodówce (chłodni) kilka do kilkunastu dni.
- Próbę do badań stanowią nerwy liści. Próba powinna być reprezentatywna dla rośliny, tzn.: do pobierania nerwów należy zebrać 3-5 w pełni rozwinięte liście (w zależności od wielkości rośliny), które wyrastają z różnych stron rośliny, unikając przy tym liści najmłodszych i najstarszych. W przypadku, gdy nie będzie możliwe zebranie dostatecznej liczby liści np. przy silnym zahamowaniu wzrostu rośliny, jako próbę do badań należy pobrać całą roślinę.
- W pierwszym rzędzie należy pobrać próbki liści z roślin wykazujących objawy karłowacenia, występowania chlorotycznych przebarwień liści, zielenienia płatków kwiatów, tworzenia utworów liściopodobnych itp.
- Pobrane próbki należy przekazać do badań laboratoryjnych załączając także "zlecenie na wykonanie badań laboratoryjnych", którego formularz można pobrać ze strony internetowej właściwego miejscowego Wojewódzkiego inspektoratu Ochrony Roślin i Nasiennictwa (piorin.gov.pl). Dodatkowo należy sporządzić i przechowywać przez 3 lata kopię "Zlecenia" oraz pisemną informację zawierającą dodatkowe dane, o ile nie zostały podane w "Zleceniu".
UWAGA: W przypadku pobierania prób w mateczniku sadzonek, identyfikacja pojedynczej rośliny może być bardzo trudna lub praktycznie niemożliwa. W takim przypadku należy trwale oznakować 1 metr bieżący, z którego należy pobrać do testów po osiem liści (jako jedną próbę). W przypadku stwierdzenia fitoplazmy usunąć rośliny z badanego metra i po jednym metrze z każdej strony (łącznie 3 metry bieżące rzędu).
Metoda laboratoryjna weryfikacji obecności fitoplazmy
Do wykrywania fitoplazm należy stosować test PCR. Metodyka izolacji kwasów nukleinowych w tym DNA fitoplazm opisane są w wielu publikacjach np. w publikacji 1 lub w materiałach dostępnych na stronie: http://cdn.intechopen.com/pdfs/37262/InTech-Polymerase_chain_reaction_for_ phytoplasmas_detection.pdf
Do izolacji można również stosować gotowe zestawy np.: DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen); Genomic DNA Purification kit (Fermentas); High Pure PCR Template Preparation kit (Roche); Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega); NucleoSpin PlantII kit (Macherey-Nagel).
Opis reakcji PCR można znaleźć w wielu powszechnie dostępnych publikacjach naukowych np. w cytowanych poniżej, lub w materiałach edukacyjnych np. „Przykłady analiz DNA” Ryszard Słomski (red.), Poznań 2001; www.e-biotechnologia.pl. W każdym przypadku należy stosować się do zaleceń producenta zestawu odczynników do reakcji PCR.
Ze względu na niską koncentracje fitoplazm w materiale roślinnym pochodzącym z warunków klimatycznych naszego kraju, zalecane jest przeprowadzenie dwuetapowej reakcji PCR (tzw. nested PCR), w której stosowane są dwie pary starterów uniwersalnych dla fitoplazm.
- źródło: inhort.pl
